结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，每年全球因结核病死亡人数为200万-300万。我国结核病患病人数居世界第二，同时结核病也是我国重点控制的重大疾病之一。而作为人类迄今为止唯一使用的结核病疫苗卡介苗，虽对儿童具有较好的保护力，但在防治成人肺结核方面的免疫效果极不稳定。

近日，扬州大学生物科学与技术学院的两位学生在老师的指导下，用将近两年的时间攻克了这一难题，创造了重组结核疫苗，他们也因此获得了第13届全国“挑战杯”竞赛一等奖。

突发奇想

大胆创新得到老师鼓励

说起这项研究初衷，大四学生陶成武告诉记者，“其实一开始想法挺天真的，没想到最后会真的成功！”

原来，这项研究源于一堂微生物课，殷月兰老师在讲到结核分枝杆菌（俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌）时，向同学们细数了结核病疫苗卡介苗的一些不足。

“卡介苗的原理是将毒性强烈的结核杆菌一代代培养下去，将毒性退化，用已退化了毒性的结核杆菌再注射到人体中，既不伤害人体，也能使人体产生免疫力，但就在卡介苗制备和传代过程中，基因组也同时丢失了部分与保护力相关的基因,使卡介苗的保护性免疫应答减弱，导致免疫效果不稳定，对结核病的预防从0到80%不等。”陶成武介绍。

“卡介苗存在这样的不足，那如果用一个载体将卡介苗丢失的保护性基因再次免疫进入机体内，这样不就可以弥补卡介苗的不足吗？”课后，陶成武就将自己的想法与殷老师进行了交流，本以为是自己一个天真的想法，却没想到得到了专业老师的称赞，并认为可行。在老师的鼓励下，陶成武和当时的大三学生连凯组队，两人开始把想法付诸实践。

追踪前沿

项目突破源于大量研究

利用载体将卡介苗丢失的保护性基因再次免疫进入机体内，但是利用什么作为载体，则成了这项研究的关键点。实验中，陶成武和连凯做了很多尝试，但结果都不太理想。研究一时陷入僵局。“那时整个人每天神经都是紧绷的，看见什么都会想一想，这个能不能作载体？”回忆起当时的情形，连凯说，那段时间几乎是吃饭、睡觉都在思索这个问题。

就在他们一筹莫展的时候，通过翻阅大量资料，连凯和陶成武发现，国际上已经有学者将活的弱毒化的李斯特杆菌（一种细菌）改造成为可以容纳外源性抗原的载体，从而制备可诱导较强细胞免疫应答的预防性或治疗性活载体疫苗。“通过查阅资料，我们发现，减毒李斯特杆菌是其中一种具有潜在应用前景的细菌载体，它具有特殊的胞内感染和免疫机制，即能突破吞噬细胞吞噬体的束缚而进入胞浆，近些年，减毒李斯特杆菌的优点受到越来越多科研工作者的关注，现已成为国际研究的热点。”连凯说。

载体找到了，那么卡介苗丢失的保护性基因又是什么？采访中，连凯坦言，国外很多研究者对卡介苗做过研究，与野生的卡介苗菌株做比较，丢失的基因前人都已做过研究，他们只需通过各种实验，将这种基因提炼出来即可。

反复实验

重组疫苗效果得到印证

“将减毒李斯特杆菌作为载体，和卡介苗丢失的基因进行重新构建，是我们的研究项目核心，而另一个核心则是对重组疫苗的免疫应答特性进行研究。”连凯解释，简单地说，也就是这个疫苗对于机体的免疫保护作用如何，还未知，因此他们实验的第二个重点就是通过一系列研究，来研究重组疫苗的免疫应答特性。

“我们在老鼠身上做了实验，前期实验中，先不注射病原菌，在两只老鼠体内分别注射卡介苗、重组疫苗，主要检测一些指标，之后在攻毒实验里，先前后两次在老鼠体内分别注射卡介苗、重组疫苗，之后注射野生型结核分枝杆菌(有毒的致病菌)，从而观察注射致病菌后，小鼠机体的免疫反应。”连凯解释，前期是为了弄清楚疫苗的一些免疫特性，攻毒实验则是为了进一步研究它的免疫保护效果如何，也就是防御病原菌感染的效果。

陶成武解释，不要小看这一操作步骤，在进行小鼠攻毒实验时，他们要进行尾静脉注射，但小鼠的尾巴本来就已经很细了，更何况上面的一根血管，到了冬天，血管收缩，操作的难度就更大了，在几次操作之后，只有连凯熟练掌握这一“打针技术”，并且每次都能一次性成功。

陶成武告诉记者，整个项目，差不多进行了两年，只要没有课，他们经常是一整天都呆在实验室。而那段时间，连凯正值考研复习阶段，为了抓紧时间准备考研，连凯总是把书带到实验室，只要一有空便拿起书看几眼。回到宿舍，不管多晚、多累，他也都会看一会儿书再睡。

“虽然那时候很累，很苦，但好在最后的实验成功了，进行注射后的老鼠各项指标都非常健康。”连凯说。

国际领先

重组菌制备简便成本低

采访中，记者了解到，此次研究中采用的减毒李斯特杆菌中稳定分泌表达结核保护性的两种基因的构建方法在国际上尚未见报道。可以说，这个研究方法具有国际首创性。“我们构建的重组菌相较于传统卡介苗的优势也是很明显的，构建的重组菌能够激发机体较强的细胞免疫，而细胞免疫对结核分枝杆菌的防御是至关重要的。”陶成武说。

陶成武介绍，构建的重组菌还具有制备简便、成本低的优势。传统的卡介苗制备需要4-5周的时间，而重组菌的繁殖很快，只需一夜。重组菌所采用的培养基也更为便宜。

“作为一种旨在预防人类结核病的候选疫苗，能否应用于医学临床，其安全性是要评估的首要问题。我们在进行了对重组菌严格的安全评价后，发现其具有较高的安全性。这都让我们有理由相信它将成为具有较好发展潜力的结核疫苗候选株。”连凯说，下一步，他们还将对重组疫苗和卡介苗的联合使用进行进一步的研究，更富挑战性的工作也刚刚开始。